很多人認為，美國農業部貝爾茲維里蜜蜂研究室的主要研究方向是蜜蜂病蟲害、非洲化蜜蜂以及蜂群防御與報警機制的研究。然而，1995年該研究室接受了一項新任務，研究蜜蜂種質或生殖細胞的保存。

    美國國會指示，美國農業部農業研究部門應制定國家遺傳資源規劃，保存重要農業物種的遺傳多樣性。農業研究局在若干地區有保存作物品種的悠久歷史。但是，這項指令要保護動物，包括昆蟲也要保存。選擇蜜蜂作為三種模式昆蟲之一，它代表膜翅目的有益昆蟲，另外兩種昆蟲是家蠅(雙翅目)和粉紅棉鈴蟲(鱗翅目)都是重要害蟲。有些研究小組已在有效利用寒冷和自然滯育(冬眠)來保存蠅類和毛蟲(鱗翅目幼蟲)害蟲，但是，對昆蟲來說蜜蜂有一種獨特的方法，即人工授精。

    一、蜜蜂人工授精和生存率

    目前，蜜蜂是具備人工授精或器械授精完善方法的唯一昆蟲。自從20世紀20年代發展起來的蜂王人工授精設備是尖端的和多種多樣的，其中包括用于采集大量精液的哈勃氏注射器。本計劃的目標之一是研制一種冷凍精液的方法。測試精子的存活率(這種方法現在應用于許多物種)對研究有很大幫助。

    精子用兩種不同的顏色染色，綠染料與精子頭內的DNA結合，紅染料只在細胞死亡時進入頭部。精于頭呈綠色的是活的，紅色頭是死的。我們計算若干個樣本，每個樣本100個精于細胞，求平均數。采用這種染色技術，我能試驗多種冷凍處理，并直接評價精子。以前研究蜜蜂精液冷凍保存的研究人員，必須等待用處理的精液給蜂王授精，蜂王開始產卵，卵成熟到足以看出是否在工蜂房里的全部卵是工蜂(受精的)，還是蜂王在不適當的位置產了雄蜂(未受精卵)。

    應用生存率染色技術，能夠回答一些基本問題。用已知活精液水平，從0％(全部是死精子)到100％(新鮮精液)的精液樣本，就能說明用大于50％活精子授精的蜂王將產正常的工蜂幼蟲，至少持續產一個季度。用低于50％活精于授精的蜂王，在工蜂房里產不同程度的雄蜂。作為蜜蜂育種專家使用此項實用技術，50％活精子是冷凍保存精液精液樣本必須達到的存活率閥值。

    采用冷凍后存活一半以上的精于給蜂王授精，就能在一個夏季培育新蜂王，這樣長的時間足以在育種程序中擴大特殊的種群。

    在設置存活率閥值時，研究人員還發現蜜蜂精子容易受到處理的傷害。精液是很濃的液體，為采集足夠一次授精用的精液或者想要保存采集來的大量的精液，使用注射器進行人工授精時，要用力吸取精液，這就大大降低了精液的存活率。有些蜜蜂育種家采用從多只雄蜂采集精液的方法，將精液在稀釋液里混合，然后再用離心濃縮。從前發表的文章，離心的速度和時間對精子的存活率影響大，速度快會損傷精于。新發表的方法，采用對精于比較溫和、較低的速度，但是濃縮精液需要的時間較長。

    二、遺傳力和生存率

    阿根廷的安德雷博士在執行養蜂發展綜合計劃，也采用這種精子生存率測定法來確定雄蜂之間的自然變異。發現雄蜂的自然變異很大，這種特殊的遺傳計量單位通稱為遺傳力。結果表明，精子生存率至少部分受遺傳的影響，在遺傳育種計劃中，從選擇雄蜂改善精子的生存率可以定為目標。

    三、精于冷凍保存

    在液氮中冷凍生物組織，必須保護細胞不受損傷。與稀釋液一起，將細胞保護劑加到精液里。稀釋精液的冷凍和解凍的速度對精子的存活也很重要。安德雷博士等試驗了多種曾經用于蜜蜂精液的溶液，以確定其中那種最適宜作為儲存精液的稀釋液。有數種含鹽和糖的生理鹽溶液，pH為7和9，重量滲透壓濃度(溶液中滲透壓活動顆粒的總數)在350和500，精于在這樣的溶液中是穩定的，并且保持活力。

    進行一系列不同稀釋液、若干常用冷凍保護劑以及各種冷凍和解凍速度的試驗，并且對精液樣本直接進行測定。最終精液樣本的存活超過了50％的閥值水平。同樣也檢測了新鮮精液的稀釋液和冷凍保護劑對授精蜂王的影響。在夏季，計劃將所有這些信息綜合在一起，形成采集和冷凍精液的標準方法。我們將用冷凍和解凍的精于給一組蜂王授精，評價它們所產的工蜂幼蟲的質量。

    四、在室溫條件下的儲存

    從人工授精的長期經驗，得知將采集的精液存放在室溫下是可能的，但不知是否能長期儲存。因此，將采集的精液，密封在毛細管中，放在黑暗房間里，室溫儲存1年。

    令人喜悅的是，精子生存率至少在8周內保持在高水平，然后慢慢下降。少數樣本沒有污染，密封很好，在儲存1年后發現它們的生存率高于50％的閥值。即便只能將精液保存數周，這種方法或許能給育種家某些自由，在有大量雄蜂時采集精液，保存到有了蜂王。

    不幸的是，試用室溫下儲存1～8周的精液給蜂王授精，大部分蜂王產的是雄蜂卵。精于是活的。但是不執行它們的任務。后來經過多次試驗，研制出一種稀釋劑剛好在授精前與精液混合，它將刺激精于達到正常的活動水平，在夏季將測試這種方法，評價產卵的蜂王。

    五、蜜蜂卵的冷凍保存

    研究計劃包括蜜蜂卵，卵3日內發育成胚胎。開始這項研究時，已經發表了在液氮中冷凍果蠅胚胎的成功方法。很幸運是，能與研究者之一的田納西州立大學的彼得·梅休爾博士一起工作。這項措施已應用到其他昆蟲的胚胎。

    蜜蜂生物學使胚胎保存成為挑戰，因為必須個別地采集卵，它們太小在處理它們冷凍時比較困難。現在，有一套良好的措施采集卵，并能讓它們在孵化器中100％孵化。在研究果蠅過程中，研究人員發現采用一定發育階段的胚胎，在冷凍后能得到較高的生存率。這對蜜蜂胚胎同樣有用，48小時的蜜蜂胚胎最能耐受冷凍。我們用精液試驗的冷凍保護劑，同樣適用于蜜蜂胚胎。為了使冷凍保護劑進入胚胎，必須將卵的外殼除去，用溫和的漂白(Clorox)溶液除去卵殼。然而用于果蠅和蚊蟲胚胎的溶劑會殺死蜜蜂的胚胎。

    因此，研究停留在這一階段，能夠保存卵要比冷凍精液更令人激動。如果這些胚胎能孵化，培育到1日齡。將它們移至無王群，按照標準方法培養蜂王將是件容易的事情。這樣培育出的蜂王能自然交配，不需要人工授精，也能培育出選作保存的遺傳種群的雄蜂。

    六、自然儲存的蜂王如何

    本計劃的最終日的是，進一步地了解蜂王為什么能在相對高的溫度下儲存精液多年，精子仍然存活，能給卵授精。研究人員相互協作，開始了一項大膽的計劃，試圖發現蜂王受精囊里發生了什么，以及雄蜂對自然儲存的精于可能有什么影響?有一些早期的資料，若干種抗氧化劑能保護細胞避免隨時間降解，它們可能以較高的水平出現在受精囊中，并隨精子存在精液里。

    在過去的幾年里，Evans博士參與蜜蜂基因組測序計劃，現在有一個蛋白質組實驗室從事蛋白質的大規模研究，特別是蛋白質的結構及其功能，使人們能解剖特殊組織，例如精于或處女王的受精囊，分離其中的蛋白質。蛋白質組實驗室然后能鑒定這些蛋白質的性質，并能從基因組項目找出與其匹配的蛋白質基劇順序。因為蛋白質在許多細胞變化過程中是關鍵的物質，可以使我們了解受精囊里發生的事情。這是一項令人激動的尖端科學，我們衷心希望能獲得一些解答，或者得到另外的種質保存的手