摘 要：本試驗以果蠅（Drosophila melanogaster）ATP合成酶16kDa蛋白脂質C亞基基因（vha16）cDNA序列為信息探針，對蜜蜂EST數據庫進行同源檢索篩選，克隆了蜜蜂ATP合成酶 16kDa蛋白脂質C亞基基因（vha16）的cDNA全序列（GenBank登記號為AY343324），該基因全長581bp。經RT-PCR克隆、序列分析驗證，結果表明與電子克隆序列完全一致。該基因具有完整的開放閱讀框（ORF），編碼蛋白為156個氨基酸。通過設計特異引物，克隆到長為2 968bp的該基因的部分基因組序列。利用Gene Finder軟件分析發現，在蜜蜂vha16基因組序列的第1~133位、第1 965~2 154位和第2 711~2 968位分別為外顯子；2個內含子分別位于第134~1 964位和第2 155~2 710位，且內含子的剪切位置均符合GT-AG規則。

關鍵詞：蜜蜂（Apis mellifera）；電子克隆；TR-PCR；ATP合成酶16kDa蛋白脂質C亞基基因（vha16）；基因結構

基于表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs）的電子克隆（in silico cloning）策略，是近年來發展起來的一門快速克隆基因的新技術，其技術核心是利用生物信息學技術組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長cDNA序列進一步利用RT-PCR的方法進行克隆分析、驗證。隨著EST數據庫的進一步完善，電子克隆策略已成為克隆新基因的重要方法，并成功地應用于人類基因組的研究[1-3]。在過去的幾年間，在許多動物的質膜上都發現了運輸質子的液泡型ATP合成酶（vacuolar-type ATPase，V-ATPase）[4-7]。在昆蟲的生理系統中，V-ATPase起著至關重要的作用，它可以產生穿膜電壓，為次級主動運輸過程如K+/2H+逆向、氨基酸/K+同向跨越質膜運輸提供能量[8-9]。而蜜蜂（Apis mellifera）V-ATPase基因序列尚未見報道。

本研究采用電子克隆的方法，以果蠅（Drosophila melanogaster）ATP合成酶16kDa蛋白脂質C亞基基因（vha16）cDNA序列為信息探針，BLAST檢索GenBank的蜜蜂EST數據庫，拼接有部分同源的EST序列，獲得蜜蜂vha16基因的cDNA全序列并經RT-PCR驗證。并在該基因的cDNA序列的基礎上，設計系列特異引物，進一步克隆了蜜蜂vha16基因組部分序列，并分析該基因組序列的結構。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株及蜜蜂

克隆載體pMD-T為TaKaRa公司產品；宿主菌E. coli TG1為本實驗室保存。試驗所用蜜蜂由福建農林大學蜂學學院教學蜂場提供。

1.1.2 工具酶及試劑

T4 DNA連接酶、plus Taq DNA聚合酶、蛋白酶K及各種限制性內切酶均為TaKaRa公司產品；逆轉錄試劑盒為MBI產品；DNA Marker 購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄合成單鏈cDNA[10]

取0.5g成年工蜂的頭部組織，加入10ml Trizol冰浴研磨，然后加入終濃度為0.3g·L-1的糖原，用1ml注射器反復吸打。室溫放置5min后加入2ml氯仿，劇烈混合3min，11 000r/min離心15min。上清移至無菌且RNase free的離心管中，加入2倍體積乙醇，12 000r/min離心5min；棄上清，以75%乙醇洗滌沉淀2次。稍干后，用無RNase的滅菌水溶解沉淀。cDNA的合成按反轉錄試劑盒說明書步驟進行。

1.2.2 蜜蜂基因組DNA的提取

取成年工蜂10只，參照LIFTOND的方法[11]提取蜜蜂基因組DNA，干燥后溶于100 μL TE，-20℃保存備用。

1.2.3 引物的設計與合成

根據電子克隆所得的完整cDNA序列，設計合成特異引物（由上海生工生物工程公司合成）：

引物1：F：5’-CGACAACCTGTAAATACTCGTG-3’

R：5’-GGTTGCAGGCGACGAGTCTTGC-3’

引物2：F：5’-CGACAACCTGTAAATACTCGTG-3’

R：5’-TGTACCTGACTTTGCTGTGCCG-3’

引物3：F：5’-GTTCTAATTGCTGGTGGTCTAG-3’

R：5’-GGTTGCAGGCGACGAGTCTTGC-3’

1.2.4 PCR擴增蜜蜂vha16基因片段

用所設計的引物1，以供試蜜蜂cDNA為模板擴增特異片段。PCR程序為94℃預變性2 min，94℃變性30 s，54℃復性45 s，72℃延伸1 min。共30個循環，72℃延伸10 min。反應完畢后取10 μl于15g·L-1瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.5 蜜蜂vha16基因組序列克隆

分別用所設計的特異引物2、3，以供試蜜蜂基因組DNA為模板，用plus Taq酶擴增特異片段。PCR程序為94℃預變性5 min，94℃變性1 min，56℃復性45 s，72℃延伸90 s。共35個循環，72℃延伸10 min。反應完畢后取10 μL于12g·L-1瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.6 重組、克隆和DNA序列分析

用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，與pMD-T載體（摩爾比3:1）連接，挑選陽性克隆，委托TaKaRa公司進行DNA序列測定。

1.2.7 蜜蜂vha16基因組序列內含子/外顯子分析

利用Gene Finder軟件（http://www.bioscience.org/urllists/genefind.htm）進行基因組序列的內含子和外顯子分析。將蜜蜂vha16基因的cDNA序列和相應的基因組序列進行對齊顯示，以確定該基因的外顯子和內含子結構。部分區域根據典型的剪切位點（GT-AG法則）進行調整。

2 結果與分析

2.1 蜜蜂vha16基因cDNA序列的電子克隆

從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的GenBank的核酸（nr）數據庫中檢索昆蟲vha16基因，獲得果蠅的vha16基因cDNA序列NM_05745[12]，以該序列為模板對蜜蜂EST數據庫進行BLAST檢索，獲得與之部分同源的蜜蜂EST群，從中選取一條EST（BI513093）作為種子序列BLAST檢索蜜蜂EST數據庫，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群（contig），再以此重疊群序列重復以上BLAST檢索過程，反復進行EST重疊群序列的拼接和比對，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續延伸[13]，最終獲得581bp的蜜蜂vha16基因的cDNA全序列，由蜜蜂dbEST中的BI513093、BI513122、BI514568、BI511976、BI508009、BI505241和BI511110等EST序列拼接而成（圖1）；經RESearch軟件分析，發現其具有完整的開放式閱讀框架（ORF），起始密碼子在第59位，終止密碼子在第527位，推測編碼156個氨基酸。

圖 1 蜜蜂vha16 cDNA序列在蜜蜂EST數據庫中的比對結果

2.2 RT-PCR驗證

PCR結果經15g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，結果出現單一條帶，約570bp，與預計大小相符（圖2）。用pMD-T載體克隆后測序，結果與電子克隆序列一致（圖3）。蜜蜂vha16基因的完整序列的GenBank登記號為AY343324。

圖 2 蜜蜂vha16 cDNA RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定

1: RT-PCR產物; 2: DNA標準分子量

2.3 蜜蜂vha16基因組序列克隆

分別用所設計的特異引物2、3擴增特異片段，PCR結果經12g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，結果出現單一條帶，分別約為2126bp和978bp（圖未列）。用pMD-T載體克隆后測序所得的2個片段序列，有146bp的重疊區域，結合電子克隆序列，可拼接獲得長為2 968bp序列（篇幅所限，序列未列出），但cDNA兩端序列未能得到延伸。

2.4 基因結構分析

利用Gene Finder軟件分析基因組序列的內含子和外顯子發現，對蜜蜂vha16基因組序列分析發現，在其第1~133位、第1 965~2 154位和第2 711~2 968位分別為外顯子；2個內含子分別位于第134~1 964位和第2 155~2 710位，且內含子的剪切位置均符合GT-AG規則。

3 討論

利用EST資料的電子克隆是克隆功能基因的新途徑，與傳統的基因克隆方法相比，具有快捷、成本低、針對性強等特點，但也受到dbEST的EST數量和質量的限制[14]，因此在EST資料非常豐富的模式物種（如人、鼠等）中應用較多。在實際應用中，以模式物種某一已知基因序列為起點，結合目標物種EST數據庫，采用現代生物信息學及實驗驗證相結合的技術方法，尤其是通過同源性比較完全有可能快速篩選到一些具有重要功能的基因。

同時，通過蛋白同源比較也可看出，蜜蜂vha16基因的推測蛋白與已知昆蟲VHA16的大小相似。所以，筆者認為本實驗中電子克隆的蜜蜂vha16基因cDNA序列是完整的，至少可以說該基因的cDNA序列，推測編碼的蛋白序列是完整的，具有完整的ORF。在該基因的結構分析研究中，曾試圖擴增非轉錄區序列，但未能取得成功，這對于全面分析該基因的結構有一定的影響。

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陳大福 福建農林大學蜂學學院