一、花粉形態(tài)分析
花粉形態(tài)分析與國際生物**合會(IUBS)的國際蜜源植物協(xié)會(ICBB)要求一致，采用Louveaux的方法，10 g花粉與50 mL水混合15 min，在分析花粉前取10 mL液體用30 mL水進一步稀釋，按照Vergeron的方法用顯微鏡對花粉粒計數(shù)。
二、物化分析
1、總酚和鞣酸
總酚和鞣酸的含量用Marigo法(有部分修正)進行測定，這種方法是基于磷鉬酸和磷鎢酸酚基團的氧化。5 g細微的花粉樣品用75 mL 70％(v/v)的甲醇振蕩提取45 min。用Buchner漏斗過濾后，殘余物用70％的甲醇沖洗并且將最后的體積稀釋到100 mL，測定提取物。PVPP(Polyclar AT，Carlo Erba，Milano，意大利)溶解在pH 3.5的10 mL花粉的甲醇提取溶液中做空白對照。PVPP作為酚類化合物的吸收劑被加人。在760 nm下讀取吸光值，分別用5、25、50、100、150和200 mg/kg的沒食子酸做標準曲線以測定酚。在pH 4下用含有1％NaCl的10％的凝膠溶液沉淀含水提取物(10 mL)，通過吸光值之差測定鞣酸。
2、黃酮類化合物
測定5g細微花粉樣品的總黃酮。在樣品中加入1 mL 0.5％的六甲基四胺(w/v)、20 mL丙酮和2 mL 0.1N的HCl，回流30 min，過濾，取濾液，用丙酮定容到100 mL，殘余物用20 mL丙酮沖洗。將10 mL的提取液與20 mL水、25 mL的乙酸乙酯置于分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次。提取物用水沖洗兩次，每次用水50 mL，隨后用乙酸乙酪定容至100 mL。根據(jù)德國藥典中的方法進行總黃酮的測定，在10 mL提取物中添加1 mL 2％的A1C13的甲醇溶液(在甲醇中添加5％的乙酸)，在425 nm下讀取吸光值，以8、16、24和32 mg/kg蘆丁制作標準。
3、游離黃酮苷元
HPLC檢測游離黃酮苷元。5 g細微的花粉樣品溶解于25mL的乙酸乙酯中，然后加入125 mL 40％(NH4)2SO4和250 mL 20％的HPO3，搖動燒瓶20 min，提取物用Buchner漏斗過濾，溶液倒入分液漏斗中，收集上層相，重復(fù)提取步驟，有機相收集到100 mL燒瓶中，在40℃以下真空干燥，樣品重新溶解在4 mL甲醇中，通過0.45 μm的網(wǎng)眼尼龍過濾并定容至5 mL。依據(jù)下列步驟進行HPLC操作：Nucleosil C18柱(10 μm)(4.6 mm×250 mm)；DAD波長278～282和278。350 nm；流動相a，雙蒸水，pH 2.6(H3PO4)；流動相b，甲醇；流速2 mL/min；甲醇濃度從0％到100％梯度洗脫33 min；進樣量20 μL。色譜柱重平衡10 min。通過外標法定量。
標準曲線是以峰面積對標準品的濃度(香草酸、丁香酸和異鼠李素5～20mdkg；對—香豆酸、鄰—香豆酸、4-經(jīng)基苯酸乙酯(對羥基苯甲酸乙酯)、反式肉桂酸、原兒茶酸、楊梅酮和看莰菲醇，5～100 mg/kg；槲皮素25～250 mg/kg；蘆丁100～1000 mg/kg)的線形回歸建立，所有的標準曲線都通過原點，相關(guān)系數(shù)接近1(0.998～0.999)。含有標準品或提取物的溶液一直是避光保存以免降解。每周甲醇中成分的穩(wěn)定性在375 nm(黃酮醇)和340 nm(黃酮)下進行分光光度檢測。
4、酚類化合物的鑒定
采用HPLC鑒定不同的酚類化合物，按照Marham的方法經(jīng)過羥基化作用、甲基化，與金屬整和，利用波長從320～380 nm和從240～280 nm的增色效應(yīng)及相應(yīng)標識物的共同色譜分析。采用光譜對照技術(shù)比較光譜圖，結(jié)合光譜圖的匹配程度和峰純度確定化合物。
控制好蜂花粉水分含量很重要，水分決定蜂花粉的微生物特性、感官品質(zhì)和產(chǎn)品的貨架期。除樣品4外，游離氨基酸的最低量為2 g/100g，顯示該樣品適宜的新鮮程度和正確干燥方法。蜂花粉的游離氨基酸含量的下降是因干燥或包裝時溫度過高，意味著營養(yǎng)下降。脯氨酸與氨基酸總量之比可當作花粉成熟度的指標。除5、7、11號樣品之外，新鮮花粉和正確加工的蜂花粉均符合此指標(＜75％)。
用分光光度法測定了多酚和黃酮成分的含量，多酚為1.24±0.20 g/100g，黃酮為0.51±0.16 g/100g。樣品不能以鞣酸為指標檢測多酚，64％的樣品顯示出多酚含量的最低值不低于1.20 g/100g。在花粉的采集過程中，蜜蜂阻斷α或β-葡(萄)糖苷酶引起糖苷部分酶水解成游離苷元。通過HPLC對游離黃酮苷元進行了定性定量的測定，其平均值為65.05±14.2 mg/100g。不經(jīng)化學水解，通過氣相色譜可判定下述游離糖的存在：葡萄糖、果糖和蔗糖，低比例的二糖：海藻糖、異麥芽糖和麥芽糖，三糖中的棉子糖、erlose和松三糖。一旦蜂花粉被水解(1.2M的HCl，90℃，50％的甲醇水溶液(Y/v)，反應(yīng)時間為60 min)，可檢測到其他的糖(如鼠李糖)，與天然游離苷元（＜95 mg/100g)相比，黃酮化合物的比例相當高(＞600 mg／100g)。
植物花粉含有大量的黃酮醇糖苷，它們存在花粉粒外壁上。酚類化合物的HPLC色譜圖不能鑒別水解的和沒有經(jīng)化學水解的蜂花粉樣品。我們不能鑒別蜂花粉的植物來源。按照表1和表2所得到的結(jié)果，游離類黃酮苷元能用來確定蜂花粉的質(zhì)量。
多酚氧化酶是一種廣泛存在植物中，能催化酚類化合物氧化和聚合成褐色素。乙酸乙酯和甲醇提取可以降低酶的活性。提取時間從30分鐘延長到45分鐘或樣品量由3克增加到5克并沒有影響提取效率和降解組分。與其他食品比較，蜂花粉中總多酚的含量偏高。
黃酮苷元與蜂花粉的質(zhì)量相關(guān)，這些化合物的最小值可以作為產(chǎn)品可接受的指標。在最近的研究中，多酚、單寧、類黃酮、兒茶酚、表兒茶酸在鑒定可可粉、水果、蔬菜和加工食品的品質(zhì)中是關(guān)鍵的指標。蜂花粉黃酮昔元的HPLC色譜圖表明有15種組分，這15種化合物中能鑒別出13種。下面是被鑒定的化合物：①安息香酸衍生物(C6-C1)(3，4二羥基苯甲酸，原兒茶酸，4-羥基苯甲酸乙酯，香蘭酸，丁香酸)；②羥基肉桂酸(C6-C3)(對香豆酸，正香豆酸，反肉桂酸)；③黃酮醇和黃酮(C6-C3-C6)(蘆丁、槲皮素、茨非醇、楊梅酮、異鼠李素)。蘆丁(槲皮素糖苷)是最重要的類黃酮糖苷的成分。11種化合物的組分相似，主要含有黃酮醇。方差分析表明11種蜂花粉的多酚、類黃酮化合物的含量有顯著性差異(P≤0.05)。在鑒定的酚類化合物中，蘆丁有最高的清除ROO-自由基的活性(以摩爾為單位)和人體紅血球的光敏水解保護效果。
一般而言，黃酮醇和從葉、種子、水果發(fā)現(xiàn)的類黃酮是不錯的抗氧化劑。除對肉桂酸以外，蜂花粉的酚酸類(經(jīng)基肉桂酸和羥基苯甲酸)也都是很好的抗氧化劑。抗氧化活性隨著臨位二羥基基團的增加而增加。檢測蘆丁是檢驗蜂花粉質(zhì)量的一種方法。蘆丁含量較低表明蜂花粉貯藏期長或在干燥過程中加熱過度。蜂花粉蘆丁含量較高(29±7.98 mg/100g)，從18.35 mg/100g到44.45 mg/100g波動。蜂花粉的質(zhì)量能從生物活性和營養(yǎng)價值方面給予充分的評價。因而，在歐洲市場上標準化西班牙市場銷售的蜂花粉，蘆丁最小含量為20 mg/100g。蜂花粉的質(zhì)量與保存期相關(guān)，營養(yǎng)價值和生物活性隨著產(chǎn)品質(zhì)量的不同而不同。
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