蜜蜂人工授精技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用進(jìn)展
吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所 薛運(yùn)波
摘要：從國(guó)內(nèi)外探索研究蜜蜂人工授精技術(shù)發(fā)展進(jìn)程，人工授精技術(shù)對(duì)蜜蜂育種技術(shù)發(fā)展的影響，人工授精技術(shù)在蜜蜂育種工作中的應(yīng)用以及蜜蜂人工授精技術(shù)的應(yīng)用前景等4個(gè)方面進(jìn)行了闡述，使人們對(duì)該技術(shù)能夠進(jìn)一步加深了解和更好地發(fā)揮作用。蜜蜂人工授精技術(shù)的成功應(yīng)用，推動(dòng)了蜜蜂育種技術(shù)的發(fā)展，其重要性在于為蜜蜂細(xì)胞學(xué)研究、遺傳學(xué)研究和育種工作中原良種保存繁育、單群選擇、近交系、自交系、純系的培育以及大規(guī)模的雜交組合配制等提供了可靠高效的實(shí)驗(yàn)手段。
關(guān)鍵詞：蜜蜂；人工授精技術(shù)；研究應(yīng)用
1 蜜蜂人工授精技術(shù)的發(fā)展歷程
1.1 國(guó)外對(duì)蜜蜂人工授精技術(shù)的研究
文獻(xiàn)記載，人類在200多年以前開始探索蜜蜂人工授精技術(shù)。18世紀(jì)到19世紀(jì)初，人們探索蜜蜂人工授精的方式方法比較雜亂，有人把雄蜂精液滴在蜂王的蛹或成蟲上，也有人把雄蜂精液涂到未受精卵上，或者在蜂王體表的不同部位進(jìn)行授精，但都沒有成功。1814年瑞士科學(xué)家F.于北，最早進(jìn)行蜜蜂人工授精試驗(yàn)，他用一種毛筆狀的工具，把雄蜂精液涂抹在蜂王陰道口上，雖然這個(gè)嘗試未能成功，但他的試驗(yàn)給后來人以有益的啟示。1883年德國(guó)W.汪克勒設(shè)計(jì)了一個(gè)能插入蜂王陰道的注射針頭，稱其為“人工陰莖”，使用時(shí)裝在一只注射器上。1887年美國(guó)N.W.麥克萊恩用木板制造了一個(gè)蜂王夾板，把蜂王固定在夾板的凹槽里，夾板外露出蜂王腹部末端幾節(jié)，用一支皮下注射器和一枚加工過的針頭采集雄蜂精液并進(jìn)行人工授精。19世紀(jì)末還有人采用玻璃細(xì)管進(jìn)行采精，精液用生理鹽水稀釋后給蜂王授精。同一時(shí)期，多個(gè)國(guó)家先后出現(xiàn)了用手或簡(jiǎn)單裝置把蜂王固定住，一手拿著雄蜂，試圖在人手的撮合下，使雄蜂和蜂王進(jìn)行交配；后來，還有人把雄蜂精液滴入到性成熟蜂王打開著陰門里。進(jìn)行這種“手持交配”經(jīng)歷了一個(gè)很長(zhǎng)的時(shí)期，從19世紀(jì)末到20世紀(jì)50年代很多人都進(jìn)行了這種試驗(yàn)。但是前蘇聯(lián)V.V.特里亞斯特經(jīng)過多次認(rèn)真試驗(yàn)后得出的結(jié)論是：無論采用哪種“手持交配”的方法，精于進(jìn)入蜂王受精囊的數(shù)量都很少，其精子數(shù)量只有自然交尾的0.5％～2.0％，沒有實(shí)用價(jià)值。此后，還有人把大量的雄蜂和蜂王囚禁在籠內(nèi)進(jìn)行交配嘗試，都沒有成功。1924年美國(guó)R L 沃森開始研究蜂王人工授精技術(shù)。他熟悉吹玻璃管技術(shù)，因而設(shè)計(jì)制造了微量注射器。1927年沃森設(shè)計(jì)成功了微量注射器和授精裝置，把微量注射器安裝在具有兩向?qū)к壍陌筒抗懿倏v系統(tǒng)上，再組裝在體視顯微鏡臺(tái)上，控制注射器的移動(dòng)，蜂王固定夾板用橡皮筋固定在鏡臺(tái)的另一端，用解剖鑷子張開蜂王的背腹板進(jìn)行人工授精，結(jié)果取得了前所未有的成績(jī)。因此，世界公認(rèn)沃森為現(xiàn)代蜜蜂人工授精技術(shù)的創(chuàng)始人，這種技術(shù)又稱之為蜂王器械授精。
1928年美國(guó)W.J.諾蘭掌握了沃森的蜂王授精器械操作技術(shù)后，設(shè)計(jì)制造了拉開蜂王螫針腔的彈夾、背鉤和腹鉤，用玻璃管制作成了蜂王固定器。1930年美國(guó)H.H.萊德勞將二氧化碳通入蜂王固定器的管內(nèi)作為麻醉劑，使蜂王麻醉，便于人工授精操作。1931年萊德勞制造出了一個(gè)馬蹄形的彈夾，用以打開蜂王螫針腔。1933年萊德勞解剖了一些自然交尾后返回蜂巢的蜂王，他發(fā)現(xiàn)在蜂王陰道中部有一個(gè)舌狀陰道瓣突的作用如同一個(gè)閥門，在它突起時(shí)完全關(guān)閉中輸卵管的開口，對(duì)蜂王交配后防止精液外流和促使精于轉(zhuǎn)移到受精囊中有重要作用，同時(shí)得出結(jié)論，人工授精針頭必須越過陰道瓣突把精液注入到輸卵管內(nèi)。他用一個(gè)細(xì)金屬環(huán)使陰道瓣突倒下，以露出中輸卵管口。1944年萊德勞根據(jù)蜂王陰道內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)，制造了用于壓低陰道瓣突的陰道探針，人工授精時(shí)讓針頭沿著陰道探針的背面順利進(jìn)入到蜂王中輸卵管內(nèi)。
20世紀(jì)30年代以后美國(guó)H.H.萊德勞、O.W.麥肯森、W.J.諾蘭、W.C.羅伯茨、J.R.哈博、德國(guó)F.魯特納以及前蘇聯(lián)T.A.阿維季相等人對(duì)蜜蜂人工授精注射器、針頭、蜂王麻醉器以及注射操縱裝置等部件不斷進(jìn)行改進(jìn)。
1944年美國(guó)W.C.羅伯茨等人發(fā)現(xiàn)蜂王有重復(fù)交配現(xiàn)象，蜂王須與6～9只雄蜂交配，認(rèn)為對(duì)每只蜂王進(jìn)行人工授精也須應(yīng)用多只雄蜂的精液，才能達(dá)到與自然交尾相同的效果。1947年O.W.麥肯森發(fā)現(xiàn)，用二氧化碳作麻醉劑不僅對(duì)蜂王無害，而且還有消除發(fā)情反應(yīng)和刺激蜂王提早產(chǎn)卵的作用。麥肯森還研究了隔膜式注射器，使人工授精的工作效率和成功率有了很大提高。
20世紀(jì)在世界上通用的麥肯森注射器就是以他的姓名命名的。麥肯森注射器研究成功后第3年，H.H.萊德勞設(shè)計(jì)了帶有螺旋推進(jìn)導(dǎo)軌并與麥肯森注射器配套的人工授精儀，萊德勞還首先使用了抗生素的稀釋液，降低了細(xì)菌對(duì)精液的污染，提高了人工授精蜂王的成功率。20世紀(jì)80年代，德國(guó)F.魯特納等人又設(shè)計(jì)了一種結(jié)構(gòu)精密、性能優(yōu)良的多向?qū)к壍娜斯な诰珒x。至此，蜜蜂人工授精技術(shù)、儀器設(shè)備以及理論研究，均達(dá)到相當(dāng)高的水平。
2003年周瑋譯“小型萬維手動(dòng) schley Ⅱ型人工授精儀的改進(jìn)”。該文介紹了 schley 公司長(zhǎng)期致力于人工授精儀技術(shù)的教學(xué)實(shí)踐，面對(duì)眾多不同需求的學(xué)生工作，促使 schley 公司設(shè)備不斷改進(jìn)創(chuàng)新，每次技術(shù)改進(jìn)都使設(shè)備更加實(shí)用。對(duì)于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿鄯溆N工作者而言，蜜蜂人工授精技術(shù)是一項(xiàng)十分重要的技術(shù)，新型的 schley Ⅱ型人工授精儀它使得蜜蜂人工授精技術(shù)更加容易掌握。
1.1.1 雄蜂精液采集與常溫貯存及授精技術(shù)的研究進(jìn)展
1969年美國(guó) Poole 和 Taber 在試管內(nèi)貯藏雄蜂精液已經(jīng)獲得成功，在室溫下能夠?qū)⒕嘿A藏13個(gè)星期，1970年他們用麥肯森注射器采集精液，然后經(jīng)過離心，火焰封口，在10～13℃下貯藏35個(gè)星期。并用麥肯森注射器采集精液，然后經(jīng)過離心、火焰封口，進(jìn)行貯藏。這種方法把精液從注射器轉(zhuǎn)注到毛細(xì)管不僅要花費(fèi)時(shí)間，而且使精液容易受到污染。1974年 Harbo 設(shè)計(jì)了一種能在可裝卸的毛細(xì)管內(nèi)注射器和貯存精液的注射器，毛細(xì)管的容量為50～60 μL，一端拉成針頭。使用這種注射器就不需要將精液轉(zhuǎn)注到貯藏管內(nèi)，也不需要離心了，直接可進(jìn)行人工授精。但是，它不能精確控制精液的移動(dòng)，玻璃拉制的針頭和推桿容易破損。1980年 Katanoglu ＆ Peng 把麥肯森注射器的針頭加以改造，研究成功了一種新型注射器。這種新型注射器既可用來貯藏精液，又可進(jìn)行人工授精。該注射器有良好的吸力，又有平衡壓力的泄壓孔，在拆裝時(shí)不覺動(dòng)毛細(xì)管內(nèi)的精液柱，還有一個(gè)精確的控制機(jī)構(gòu)。每個(gè)貯藏管盛裝的精液可以給多只蜂王授精。同時(shí)他們還研究了采集雄蜂精液的漂洗技術(shù)。其精液采集器由漂洗精液的漏斗、聚乙烯連接管和精液采集管三部分組成。此漂洗方法操作容易而快速，無需借助于顯微鏡，在短時(shí)間內(nèi)能夠容易地采集到大量的雄蜂精液，它比傳統(tǒng)的采集精液的方法更快速。
1.1.2 影響進(jìn)入人工授精蜂王貯精囊內(nèi)精子數(shù)量的研究
1944年以前人們認(rèn)為蜂王只與一只雄蜂交配，因此早期蜜蜂人工授精僅以1.0～2.5 mm3 (μL)精液來授精，其進(jìn)入蜂王貯精囊內(nèi)精子數(shù)量平均沒有顯著差別。
1951年 Trysko，1954年 Tdber，1955年 Woyke 發(fā)現(xiàn)蜂王在一次婚飛中可進(jìn)行多次交配。1960年波蘭J.Woyke發(fā)現(xiàn)一次成功的自然交尾后的蜂王在它們貯精囊內(nèi)大約有5.34百萬個(gè)精于。一個(gè)雄蜂可射出11百萬個(gè)精子，幾乎是蜂王貯精囊裝載的2倍。然而用1 mm3 精液約7.0百萬個(gè)精子給蜂王人工授精時(shí)，僅有1.39百萬個(gè)精子(20％)進(jìn)人蜂王貯精囊，若使用8 mm3 精液(約56百萬個(gè)精于)給蜂王進(jìn)行人工授精，進(jìn)入蜂王貯精囊內(nèi)的精于只有授精量的9.6％；1964年美國(guó) Mackense 的試驗(yàn)為5.2％。因此，Woyke 建議凡僅一次人工授精的蜂王可用8 mm3 精液。分作兩次人工授精時(shí)，每次可用4 mm3 精液，并認(rèn)為進(jìn)人蜂王貯精囊內(nèi)的精子數(shù)多少取決于注射精液數(shù)量(Mackense，1964)。1960年 Woyke，1975年 Foti 發(fā)現(xiàn)自然交尾的蜂王，貯精囊較大的比貯精囊較小的含有更多的精子數(shù)。
1970年 Vesely 授精后的蜂王放在核群內(nèi)自由活動(dòng)，則它的輸卵管內(nèi)的精液會(huì)排除干凈，可增加進(jìn)入貯精囊的精子數(shù)。反之，蜂王被保存在紗籠內(nèi)，則精液會(huì)滯留在輸卵管內(nèi)。1967年、1971年 Woyke 移植最小的幼蟲培育出的蜂王，可增加貯精囊進(jìn)入的精子數(shù)。1973年 Woyke ＆ Jasinski 授精后把蜂王保存在溫度為34℃處，比把蜂王放回溫度較低的哺育籠內(nèi)進(jìn)入貯精囊內(nèi)的精于數(shù)量多。1974年 Woyke，Jasinski 和 Smagowska 發(fā)現(xiàn)，用相等數(shù)量的精液不同種系的蜂王進(jìn)行人工授精，其貯精囊內(nèi)的精子數(shù)目在統(tǒng)計(jì)學(xué)上意大利蜂)(高加索蜂的雜交王顯著高于高加索蜂x卡尼鄂拉蜂的雜交蜂王。1975年 Foti，Grosu和D，agan 報(bào)道，蜂王在授精前后與30只工蜂一起關(guān)在籠內(nèi)，其結(jié)果與蜂王保持在核群內(nèi)一樣。1976年 Woyke 和 Jasinski 當(dāng)蜂王達(dá)到5～14日齡時(shí)可進(jìn)行人工授精。
1979年 Woyke 報(bào)道了工蜂與蜂王的接近對(duì)人工授精結(jié)果的影響，總共96只蜂王，各以8 mm3 精液進(jìn)行人工授精，授精后的蜂王被分放到：1)在不伴有工蜂的哺育紗籠內(nèi)；2)帶有10個(gè)工蜂的哺育紗籠內(nèi)；3)具有隔王片的哺育籠內(nèi)；4)在兩面具有隔王片的10 × 6.5×2.5 cm的雄蜂蜂籠內(nèi)；5)在兩面具有隔王板片帶有巢脾的16× 6.5×2.5 cm的小隔離器內(nèi)；6)在能夠遮蓋整個(gè)巢脾26×36 cm具有隔王板片的大型隔離器內(nèi)。授精后48 h解剖蜂王，檢查輸卵管內(nèi)精于的存在，并計(jì)算貯精囊內(nèi)的精子數(shù)，其結(jié)果是：在紗籠里無論有無工蜂伴隨蜂王，有5.6％的蜂王輸卵管內(nèi)有殘留的精液；而保存在隔王籠或隔王器內(nèi)的蜂王，有4.7％的蜂王輸卵管內(nèi)有殘留的精液。在沒有工蜂伴隨的紗籠內(nèi)的蜂王，其貯精囊內(nèi)只有3.02百萬個(gè)精子；在配備有隔王片的隔離器內(nèi)的蜂王，其貯精囊的精子增加75％。因此，建議授精后的蜂王應(yīng)放在有隔王片制造的隔王器內(nèi)的巢脾上，直到它開始產(chǎn)卵。
1982年 Woyke 等人報(bào)道了伴隨工蜂數(shù)量對(duì)保存的室外小交尾群的人工授精蜂王貯精囊內(nèi)精子數(shù)的影響將160只蜂王全部用8 mm3 精液授精，分別放入1脾和4脾兩種類型的交尾箱內(nèi)，每10群為一組，8 組每小群的工蜂數(shù)分別為：0只，50只，100只，200只，350只，500只，750只，1000只。小群放在室外，每天分別在8∶30，13∶00和20∶00用熱電偶測(cè)定箱內(nèi)外溫度。授精2天后，20只蜂王中除了5只沒有工蜂伴隨的死亡外，其余蜂王的輸卵管中仍留有殘余的精液。幾乎所有由100只或更多伴隨工蜂的蜂王的輸卵管內(nèi)有殘余的精液。1脾或4脾沒伴有工蜂的小群中的蜂王貯精囊內(nèi)精子量最少為1.4百萬和1.2百萬。50只有工蜂伴隨的蜂王貯精囊內(nèi)精于數(shù)量有兩倍增加。達(dá)到2.6百萬和2.7百萬。工蜂數(shù)量增加到200只時(shí)，貯精囊內(nèi)精子數(shù)量?jī)H稍有增加，但當(dāng)伴隨蜂數(shù)增加到350只時(shí)，貯精囊內(nèi)精子數(shù)達(dá)到3.7百萬和3.6百萬。為沒有工蜂伴隨的蜂王精子數(shù)的3倍，為有50只伴隨工蜂的蜂王精子數(shù)的1.4倍，進(jìn)一步增加工蜂數(shù)直到1000只，貯精囊內(nèi)精于只有很少或沒有增加，平均為3.95百萬和3.68百萬，差異不顯著。伴隨工蜂數(shù)量的增加，使蜂群溫度從18.0 ℃升至31.6℃。為使蜂王貯精囊得到正常數(shù)量的精于，室外小核群中的人工授精蜂王至少要有350只伴隨工蜂。
1982年美國(guó)A.B.伯爾坦等報(bào)道了少量多次授精與蜂王貯精囊中的精于量，用少量的稀釋精液給蜂王多次授精，進(jìn)人貯精囊中的精子數(shù)量顯著多于等劑量的一次性授精（P＜0.01)。數(shù)次相同的小劑量授精，第二次授精進(jìn)入貯精囊中的精于數(shù)量高于第一次，使用液態(tài)氮(-196℃)貯存的精液，在不同的兩組試驗(yàn)中，第二次授精進(jìn)入貯精囊的精子數(shù)分別占總數(shù)的77％和68％，用新鮮的稀釋精液時(shí)第二次占61％。
1983年 Woyke 報(bào)道精于進(jìn)人人工授精蜂王貯精囊的動(dòng)態(tài)，授精1 mm3 ，2 mm3 ，4 mm3 或8 mm3 的蜂王，每只蜂王帶伴隨工蜂250只，放在34℃溫箱內(nèi)或不帶工蜂關(guān)在無王群內(nèi)，最初4 h授精量與有無工蜂對(duì)精于進(jìn)入貯精囊的速度影響極小，為20～30萬/h。授精1 mm3 和2 mm3 的蜂王，4～8 h后轉(zhuǎn)移過程基本結(jié)束，但授精8 mm3 的蜂王，至少要延長(zhǎng)到40 h。有無工蜂，在授精1 mm3 或2 mm3 時(shí)，對(duì)貯精囊內(nèi)最后精于數(shù)只有小的或沒有影響。而授精4 mm3 或8 mm3 時(shí)，和工蜂關(guān)在一起的蜂王貯精囊內(nèi)的精子數(shù)明顯多于不帶工蜂的蜂王。因此，在采用大精液量授精時(shí)，工蜂和蜂王關(guān)在一起是很重要的。
1992年拜斯.B報(bào)道了“溫度對(duì)人工授精蜂王的影響”。該文介紹了海角蜜蜂蜂王自然交尾后，貯精囊內(nèi)有精于659萬。而人工授精8 mm3 精液，貯精囊內(nèi)才有精子503萬。人工授精量每次以4mm3 較好，用8mm3 時(shí)則精液量過大，反而妨礙了精子進(jìn)入貯精囊內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證明，人工授精前后，蜂王放入王籠內(nèi)，用200只工蜂陪侍，溫度保持在34℃，相對(duì)濕度40％最為適宜。相對(duì)濕度越高，進(jìn)入貯精囊內(nèi)的精子數(shù)越少。
1.2 國(guó)內(nèi)蜜蜂人工授精技術(shù)的研究
我國(guó)早期見于報(bào)刊介紹蜂王人工授精技術(shù)的是舒少質(zhì)先生，他在1929年《華北養(yǎng)蜂》月刊第1卷第6期刊發(fā)了“蜂王人工授精法之現(xiàn)實(shí)”。周慶章先生在1932年《養(yǎng)蜂月刊》第3卷第2期、第4期、第7期，1933年第4卷第3～5期刊發(fā)了“蜂王人工交配之研究”。鄒雪蓉、李怕琳、鄭國(guó)安在1963年《中國(guó)養(yǎng)蜂》第2期刊發(fā)了“蜂王人工授精技術(shù)”。
20世紀(jì)50年代末，我國(guó)蜜蜂人工授精技術(shù)進(jìn)人應(yīng)用研究階段。1959年現(xiàn)代養(yǎng)蜂家、北京市農(nóng)林科學(xué)院周崧研究員進(jìn)行了人工授精技術(shù)研究，他在玻璃授精針頭、授精儀的改進(jìn)以及仿雄蜂生殖器授精針頭等方面進(jìn)行了研究和探討，1964年蜂王人工授精技術(shù)在育種工作中得到實(shí)際應(yīng)用。
1964年現(xiàn)代養(yǎng)蜂家、中國(guó)農(nóng)科院蜜蜂研究所黃文誠(chéng)研究員主持“蜂王人工授精技術(shù)的研究”，突破了向蜂王生殖道內(nèi)注射精液外溢的技術(shù)難關(guān)，人工授精的蜂王85％以上都能產(chǎn)受精卵。
1978年中國(guó)農(nóng)科院蜜蜂研究所受農(nóng)業(yè)部委托，在江西舉辦了第一期‘全國(guó)蜜蜂人工授精技術(shù)訓(xùn)練班”，正式向全國(guó)養(yǎng)蜂重點(diǎn)區(qū)和有關(guān)教學(xué)、科研等單位推廣這一新技術(shù)。
1978年陳克利在《中國(guó)養(yǎng)蜂》第3期發(fā)表“蜜蜂人工授精”，介紹了蜜蜂人工授精的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作方法，并通過試驗(yàn)表明2次授精比1次授精的效果要好，兩次授精每次6 μL或8 μL，一次授精為7～9 μL。